فيزيک امواج فراصوتي در سونوگرافي

هرموج شنوایی یا فراصوتی یک آشفتگی مکانیکی در یک محیط گاز، مایع و یا جامد است که به سوی بیرون از چشمه صوتی و با سرعتی یکنواخت و معین حرکت می کند. در حرکت یا گسیل موج مکانیکی ماده منتقل نمی شود.
اگر نوسانهای ذره ها درراستای عمود بر گسیل موج باشد موج عرضی است که بیشتر در جامدها رخ می دهد و اگر نوسان امواج در راستای گسیل امواج باشد موج طولی است . انتشار امواج در بافتهای بدن به گونه امواچ طولی است از این رو ما در پزشکی با این گونه امواج سروکار داریم .
اگر نوسانهای پرده یک بلندگو را بررسی کنیم که با بسامد f نوسان میکند، می تواند چگونگی رفتار صوت را ارزیابی کرد. نوسان باعث ایجاد افزایش و کاهش موضعی فشار نسبت به فشار در محیط هوا می گردد. نقطه های با فشار بیشتر فشردگی و نقطه های کم فشار انبساط نامیده می شود.
هنگام عبور امواج از ماده، ذره های موجود در ماده در اثر امواج در محلشان به پس و پیش و لرزه در می آیند، بگونه ای که انرژی تابیده در سوی موازی با لرزه ذره ها از ماده گذر می کند. ذره ها در درون ماده تنها حرکات پس و پیش را به پیروی از انرژی موج انجام می دهند. این ذره ها حرکت آزاد در درون ماده را پیدا نخواهد کرد. انرژی موجی که باعث حرکت ذره ها می گردد ،هنگام گذر باعث به هم خوردن نظم و تعادل در ماده می شوند.
ذره مادی در اثر نیرو از حالت آرامش یا تعادل در ماده خارج می شود.

ویژگیهای امواج فراصوت

طول موج:
فاصله میان دو نقطه در موج که ویژگی فیزیکی یکسانی را داشته باشند - برای نمونه دو مرکز فشردگی -را طول موج می گویند.
بسامد (f):
شمار تکرار کامل موج در یک ثانیه را بسامد یا فرکانس می گویند یکای بسامد مانند دیگر امواج ،هرتز است .پس یک هرتز یک نوسان در یک ثانیه است.
پریود (T):
پریود یا دوره تناوب طول زمانی است که موج یک زنش کامل انجام می دهد. بنابراین وابستگی میان پریود و بسامد چنین است:
f= 1/T یا T= 1/f
سرعت گسیل موج :
فاصله ای که موج در یکای زمان می پیماید سرعت گسیل موج است.
سرعت امواج فراصوتی ( همه پارامترهای فیزیکی برای صوت شنوایی و فراصوت و یا اینکه همه نوسانهای مکانیکی همانند است ) با چگالی گسیل موج و چگونگی فشردگی محیط چنین رابطه دارند:

هر چه ماده متراکم تر باشد سرعت بیشتر است یعنی هر چه مولکولها کوچکتر باشد جابجا کردن آنها ساده تر است.
هر چه توانایی فشردگی ماده بیشتر باشد ،سرعت فراصوت کمتر است .در حقیقت فشردگی کسری از تغییر حجم ایجاد شده بوسیله تغییر فشار است. البته کار به سادگی گفته بالا نیست زیرا وابستگی وارونه دارند .یعنی با افزایش یکی دیگری کاهش می یابد ( سرعت ثابت ) . سرعت گسیل موج فراصوت به بسامد بستگی ندارد.
دیده می شود که سرعت موج در بافتهای نرم به هم نزدیک است ولی سرعت امواج در استخوان بسیار بزرگتر است ( نزدیک چهار برابر ). فراصوتی با بسامد یک میلیون هرتز ( 1 MHZ ) در آب با سرعت 1500 m/sec دارای طول موج 0.15 cm است.

بازتابش
امواج مکانیکی -که فراصوت نیز نمونه ای از آن است -دربرخورد با اجسام سر راه بازتاب می یابند. این بازتابش چند گونه دارد. در بازتابش آینه ایSPECULAR ) ( که در رویه تخت و صیقلی انجام می گیرد ،راستای تابش و بازتاب یکی است. در بازتابش نا آینه ای موج به رویه ناصاف برخورد می یابد.
گونه دیگر از بازتابش، پراکندگی است که مانند بازتابش ناآینه است تنها در این بازتابش موج به ذره کوچک برخورد می کند و این ذره خود مانند چشمه فراصوت کارمی کند و در همه راستاها،موج گسیل می شود.
برخورد امواج فراصوتی به مرز میان دو محیط:
هنگامی که موجی با زاویه عمود به مرز مشترک دو بافت برخورد می کند، بدون هیچ انحرافی از محیط دوم و در راستای تابش گذر می کند .البته بخشی در همان راستا بازتاب می شود. اگر تابش امواج به گونه مایل به مرز مشترک بافتها انجام گیرد و سرعت صوت c در دو محیط یکسان نباشد موج در محیط دوم شکسته می شود .

قانونهای اسنل
هنگامی که موج فراصوتی به مرز مشترک دو محیط برای نمونه هوا – بافت برخورد نماید ،بخشی از آن بازتاب پیدا کرده و بخشی به درون آن راه می یابد. برابر قانون های اسنل:
(a موج تابشی و بازتابشی و گذری در یک صفحه اند.
(b زاویه تابش با زاویه بازتابش برابر است.
اگر تابش به اندازه ای برسد که زاویه شکست 90 درجه شود، یعنی مماس بر مرز مشترک دو محیط،
زاویه تابش در این حالت زاویه بحرانی نامیده می شود.
در این حالت موج وارد محیط دوم نخواهد شد و بازتاب کلی داریم.
نمونه سرعت فراصوات در بافت نرم 1540 m/s است .اگراین سرعت در استخوان 4080 m/s باشد و زاویه بحرانی نزدیک به 22 درجه باشد ،هیچ گونه انرژی فراصوت وارد استخوان نخواهد شد.

ضریب بازتابش و گذر:
امواج هنگامی که به مرز مشترک دو محیط مادی می رسند می توانند از آن گذر کنند. از دید فیزیکی چنین حالتی هنگامی رخ می دهد که دو محیط در تماس کامل باشند. اگر امپدانس صوتی دو محیط برابر باشد امواج بدون اینکه تحت تاثیر دو محیط باشند از آن محیط می گذرند ( البته شکست می تواند صورت بگیرد ) ولی زمانی که امپدانس های صوتی دو محیط با هم برابر نباشند موج تابنده به پیروی از شرایط فیزیکی دو محیط - سرعت و فشار ذرات - در مرز مشترک به دو بخش بازتابشی و گذری تقسیم می شود.

هنگامی که امواج صوتی به دیواره سخت برخورد می کنند ( برخورد امواج صوتی به کوه ) بازتاب می یابند. در این جا بازتاب یا اکو یا پژواک هنگامی بوجود می آید که اندازه های دیواره سخت ( رویه بازتاب کننده ) نسبت به طول موج امواج تابشی بسیار بزرگتر باشد .
هر اندازه که دانسیته یا چگالی محیط دوم ( رویه بازتاب کننده ) بیشتر باشد دامنه بازتابش بلندتر و امواج شنیدنی آشکارتر خواهد بود.( برخورد فریاد با سنگهای کوه ) . از سوی دیگر هر چه طول موج تابنده کوچکتر باشد بازتاب اکو بهتر انجام می شود ( مانند این است که رویه بازتاب دهنده بزرگتر است ). از گفته های بالا پیداست که پدیده بازتابش درباره امواج فراصوت که طول موج کوتاهتری دارند ،بهتر انجام خواهد گرفت.
برای نمونه اگر غده یا توموری به اندازه های 4 x 4 x4 سانتی متر در بافت کبد وجود داشته باشد ،به علت اختلاف امپدانس صوتی میان بافت سالم کبد و بافت توموری و همچنین اختلاف بزرگ میان طول موج فراصوت ( نزدیک به 1 میلیمتر ) و اندازه های تومور ( نسبت 1/40 ) امکان بازتاب در مرز مشترک غده و بافت سالم وجود خواهد داشت و بازتابش در این مرز مشترک به بهترین صورت نمایان می شود.


جذب و کاهش شدت امواج فراصوتی


جذب
هنگام گذر موج فراصوتی در محیط انرژی آن جذب محیط می شود. دراین پدیده انرژی گرفته شده از موج تابشی آغازین ،پس از زمان ویژه ای به نام زمان دیرکرد به موج تابشی نخستین می پیوندد. جذب شدید انرژی موج فراصوتی تابشی ،هنگامی انجام می گیرد که در پدیده رهایی از فشار، موجی که به موج تابشی آغازین می پیوندد در برابر آن باشد ( اختلاف فاز ) در اینجا اندازه انرژی جذب شده به اندازه انرژی تابشی آغازین که تغییر شکل داده بستگی خواهد داشت.
در بسامدهای پایین فراصوتی ،زمان دیرکرد که انرژی تغییر شکل یافته به موج تابشی آغازین می پیوندد کوچک و نادیده گرفتنی است ،پس جذب شدید نیست ولی اندازه جذب با افزایش بسامد افزایش می یابد و هنگامی به بیشترین اندازه خود میرسد که انرژی تغییر شکل یافته برای پیوستن به موج تابشی آغازین درست در برابر آن جا گیرد ( اختلاف فاز کامل ). اگر بسامد از این اندازه بالاتر رود زمان برای تغییر شکل انرژی کوچک شده و در اینجا اندازه جذب ،باز کاهش می یابد.


تضعیف
تضعیف جمع انرژی هایی است که بعلت جذب و پراکندگی از موج تابشی برداشته می شود. این کاهش با جنس ماده ( ویسکوزیته ) و بسامد تابش بستگی دارد.
اگر شدت و دامنه موج تابشی آغازین پیش از برخورد به بافت Io و Ao ( در فاصله x=o ) و در ژرفای x سانتی متر I و A باشد میان دو شدت و دو دامنه بستگی زیر وجود دارد.
I = Io e-μx وA = AO e-μx ضریب تضعیف موج فراصوتی در یک ماده یا بافت است. در گذر انرژی فراصوتی از یک محیط- برای نمونه یک بافت- اگر dB را بر سانتیمتر بخش کنیم پایای بگونه dB/cm بدست می آید . این پایا به امپدانس صوتی، ویسکوزیته محیط و بسامد بستگی دارد بنابراین می توان آنرا dB/cm/MHZ هم نشان داد. نام دیگر این یکا Neper/cm است . دیده می شود که هرچه محیط فشرده تر باشد کاهش بیشتر است. برای نمونه این ضریب برای ماهیچه بیشتر از خون است و این در سونوگرافی با ارزش است. برای نمونه اگر نگاره سونوگرافی را بررسی کنیم نقطه های روشن نشان دهنده بافتهای نرم است،زیرا در اینجا کاهش کوچکتری نسبت به نقطه های تاریک انجام گرفته است و موج فراصوتی با انرژی بیشتری همراه است ( یک کیست هیداتیک ) در جایگاههای نقطه های تیره بافتهای سخت تر وجود دارد و در این نقطه ها کاهش بیشتری داریم ( مانند یک تومور ). تغییرهای شدت موج فراصوتی بگونه ای نمائی (اکسپوتانسیل) انجام می شود .
نگاره های صوتی یا سونوگرام بر پایه بازتابش و کاهش انرژی بدست می آیند. برای نمونه اگر 90% شدت فراصوت در گذر از یک سانتی متر بافت کاهش یابد ،پس از پیمایش یک سانتیمتر تنها 10% از شدت آن باقی می ماند و پس از پیمایش 2 cm این اندازه به 1% و پس از 3 cm به 0.01% و ... می رسد. این کار را با بکارگیری دسی بل می توان نشان داد. پس از یک سانتیمتر:
dB = 10 log10 I2/I1
(-1) = -10 => dB = -10 * dB= 10 log10 10/100 = 10
نشانه منفی ، نمایشگر این است که با گذر موج از ماده از شدت آن کاسته می شود . با همین روش میتوان دسی بل را پس از 2 سانتیمتر به ترتیب -2 dB و -3 dB به دست آورد.
برای به دست آوردن اندازه کاهش انرژی فراصوت در گذر از یک فاصله در یک محیط ضریب تضعیف محیط را در فاصله گذر آن ضرب می کنند.
کاهش انرژی در یک بافت در حالتهای مختلف متفاوت است ولی در کاربرد آن را یکسان می گیرند.


اثر داپلر
هنگامی که امواج صوتی یا فراصوتی به یک دیواره سخت برخورد نمایند بازتاب می کنند. در این بازتاب چنانچه چشمه تابش صوت و گیرنده ثابت باشند بسامد امواج تابنده و بازگشتی با هم برابرند .
اگر گیرنده به سوی چشمه موج حرکت کند و یا چشمه موج به سوی گیرنده حرکت نماید - چشمه موج و گیرنده به هم نزدیک شوند -طول موج بازتاب یافته فشرده شده و بسامد آن افزایش می یابد. بر عکس اگر گیرنده یا چشمه موج حرکت کرده و فاصله آنها زیاد شود بسامد موج بازتاب کاهش می یابد.
با توجه به این که سرعت گسیل فراصوت ثابت است ،تغییر در طول موج به گونه ای مستفیم بر بروی بسامد اثر خواهد گذاشت. این اثر داپلر خوانده می شود. هنگامی که قطاری با سروصدای زیاد به شما نزدیک و سپس دور می شودتغییر بسامد بوق قطار که بگونه پیوسته نواخته می شود،بعلت اثر داپلر به آسانی تشخیص دادنی است.

پدیده داپلر در تشخیص پزشکی با به کارگیری فراصوت ارزش فراوانی دارد که پس از این درباره آن گفتگو خواهد شد.

تولید و آشکار سازی امواج فراصوتی:
خفاشها نوسانهای مکانیکی فراصوت تولید و در فضا پخش می کنند و با در یافت پژواکهای ( بازتابها ) این امواج - پس از برخورد با دیواره که ممکن است شکار باشد -کار ره یابی را انجام می دهند.
در جنگ جهانی دوم دانشمندان دریافتند که اندیشه تولید امواج فراصوت را می توان درره یابی کشتیها بکار گرفت و پس از جنگ ،مهندسان دستگاههایی را برای کاربردهای تشخیصی و درمانی فراصوت ساختند.
فراصوت به روشهای گوناگونی تولید می شود که از آنها می توان دو روش پیزوالکتریسیته و مگنتواستریکسیون را نام برد.

الف- اثر پیزوالکتریسیته
بر هم کنش فشار مکانیکی و نیروی الکتریکی را در یک محیط اثر پیزو الکتریسیته می گویند.
فشردن برخی از بلورها در راستای ویژه ای از بلور نیروی الکتریکی ایجاد می کند و بر عکس ایجاد اختلاف پتانسیل در دو سوی همین بلور و در همان راستا باعث فشردگی و انبساط آن می گردد یا به زبان دیگر تغییر بعد در آن به وجود می آورد . می توان گفت که تغییر پلاریزاسیون الکتریکی در یک بلور باعث تغییر حالت کشسانی بلور می شود و تغییر حالت کشسانی بلور باعث دپلاریزاسیون آن می گردد. اثر پیزوالکتریسیته تنها در بلورهایی که دارای تقارن مرکزی نیستند وجود دارد .
راستایی که در آن کشش یا فشار پلاریزاسیونی به موازات نیروی وارده پدید می آورد ،محور پیزوالکتریک یا محور الکتریکی بلور نامیده می شود و مواد دارای این ویژگی را مواد پیزوالکتریک می گویند.
بلور کوارتز از این دسته مواد است و از نخستین اجسامی است که این ویژگی در آن کشف گردید و هم اکنون هم برای تولید امواج فراصوت بکار برده می شود . موادی مانند بلور کوارتز، واسطه ای برای واگردانی انرژی الکتریکی به انرژی مکانیکی و بالعکس می باشند و مبدل یا ترانسدیوسر نام دارند .
بلوری از کوارتز به بزرگی یک سانتیمتر اگر زیر فشار یک اتمسفر باشد ،اختلاف پتانسیل الکتریکی یک ولت را بوجود می آورد( از این رو می توان این پدیده را در سنجش فشار بکار برد.)
اگر چه مواد بلوری طبیعی که دارای اثر پیزوالکتریسیته باشند ،فراوان هستند ولی در بکارگیری فراصوت در تشخیص پزشکی ،کریستالهایی بکار گرفته می شود که سرامیکی بوده و به گونه مصنوعی تهیه می شوند. نمونه این کریستالها ،آمیخته ای از زیرکونیت سرب و تیتانیت سرب است که در هنگام ساخته شدن می توانند پلاریزه شده و به شدت دارای ویژگی پیزو الکتریسیته گردند . همه این فراورده ها وابسته به گروهی از مواد که فروالکتریک نامیده می شوند هستند.

ب- اثر مگنتواستریکسیون
این ویژگی در اجسام فرومنیتیک تحت تاثیر میدان مغناطیسی به وجود می آید . اجسام یاد شده در این میدانها تغییر طول می دهند و بسته به بسامد جریان متناوب به نوسان در می آیند و می توانند امواج فراصوتی تولید کنند.

تكنيكهاي تشخيصي بيماري تيلريوز

تيلريا انگل تك ياخته أي اجباري داخل سلولي تمام خانواده گاوهاي وحشي و اهلي ( Bovidae ) در جهان ميباشد. و بعضي از گونه ها نشخواركنندگان كوچك را نيز مبتلا مي نمايد. بوسيله كنه هاي خانواده Ixodidae منتقل ميشوند و داراي زندگي پيچيده اي در مهره داران و بي مهره ها ميباشند. شش گونه تيلريا گاو را آلوده ميكند كه دو تا از آنها بيماري زايي بيشتري دارند : اولي بنامT. parva كه بيماري East coast fever , Corridor disease , Zimbabwean theileriosis را ايجاد و دومي T. annulata باعث بيماري Tropical theileriosis ميشود.

ديگر گونه ها كه شامل T. sergenti, T. buffeli, T. orientalis, T. taurotragi, T. mutans هستند معمولا بيماري زايي خفيفي ايجاد ميكنند. گونه T. velifera غير بيماري زا است. اغلب اين گونه ها پس آلوده كردن دام ايجاد دام ناقل در دامهاي بهبود يافته را مينمايند اما هيچ نوع داده وآماري در رابطه با رل اين ناقلين در انتقال بيماري در حالت طبيعي وجود ندارد.

گاوهاي بومي درمناطق بومي آلوده ممكن است بيماري را تحمل نموده و يا به بيماري خفيف و تحت كلينيكي مبتلا شوند. اما گاوهاي غير بومي حسا س بوده و در صورت ابتلا علائم شديدي نشان داده و يا تلف مي شوند.

همانطوريكه قبلا هم گفته شد شيزونت ها در گسترش تهيه شده از غدد لنفاوي مشخصه خوبي براي آلودگي با T. parva, T. annulata ميباشد. شيزونت گونه T. taurotragi در گسترش رنگ آميزي شده بوسيله گيمسا بخوبي قابل تشخيص نميباشد.

شيزونت T.mutans نسبت به شيزونت T. parva داراي هسته هاي بزرگتر، مسطح وبي قاعده ميباشد.

فرم پيروپلاسمي T. parva , T. annulata و T. mutans شبيه بهم ميباشد. اما معمولا T. annulata , T. mutans بزرگتر و اغلب در حال تقسيم ديده ميشود. T. velifera ممكن است بوسيله يك پرده حجاب مانند تشخيص داده شود.



تشخيص سرولوژيكي :

تشخيص وجود پادتن بصورت غير مستقيم بوسيله IFA ( indirect fluorescent antibody)

بطور گسترده براي تشخيص گونه هاي مختلف تيلريا بكار مي رود. تشخيص نوع آلودگي بخصوص آلودگي با ‍T. parva چندان در بين روشهاي ايمنولوژي قابل تمايز نمي باشد. بهترين روش سرولوژي قابل تمايز مابين گونه هاي تيلريا آزمايش غير مستقيم پادتن فلورسانس IFA ( Indirect Fluorescent Antibody ) مي باشد. در اين آزمايش هر دو مرحله شيزونت و پيروپلاسمي بوسيله لام تهيه شده و يا در محلول قابل بررسي مي باشند. براي نگهداري محلول يا لامهاي تهيه شده در مرحله شيزونتي دماي انجماد (20- تا 70- ) استفاده ميشود ولي در مرحله پيروپلاسمي براي نگهداري محلول از دماي 4 درجه يخچال و براي لامها از دماي انجماد ميتوان استفاده كرد.

سرمهاي مورد آزمايش را با ماده bovine lymphocyte lysate رقيق ميكنند و با محلول آنتي ژني در انكوباتور ميگذارند و بعد ضد ايمنوگلوبولين متصل گاوي anti-bovine immunoglubolin conjugate افزوده ميشود.



الف- تهيه لام يا اسلايد آنتي ژن شيزونت

آنتي ژن مورد استفاده براي schizont IFA test ازتيره سلولي شيزونت ليمفوبلاستوئيد Lymphoblastoid گرفته ميشود. كشتهاي سلولي را كه داراي رقت 200 ميلي ليتر شيزونت در يك ليتر شيزونت هاي آلوده ( به T. parva ويا T. annulata بوده و حاوي ده ميليون سلول در هر ميلي ليتر و حداقل 90% سلولها آلوده ميباشند ) باشد را سانتريفيوژ كرده ( بمدت 20 دقيقه در سرعت 200 دور در دقيقه در دماي 4 درجه ) و مايع روئي را دور ريخته و سلولهاي ته نشين شده را با 100 ميلي ليتر بافر ( Phosphate buffered saline) PBS در دماي 4 درجه و pH 7.2 تا 7.4 مخلوط و دوباره سانتريفيوژ ميكنيم. اين روش شستشو را سه بار تكرار كرده و در آخرين با رسلولهاي ته نشين شده را با 100 ميلي ليتر PBS مخلوط كرده تا غلظت نهائي حدودCELL/ML 7 10 درآيد.

گسترش نازك از محلول سلولي را روي اسلايد حفره دار ( از جنس تفلن )‌تهيه كرده ويا روي لام معمولي را با استفاده از لاك ناخن تقسيم كنيم . هر گسترش بايد داراي 50 تا 80 سلول سالم در هر ديد ميكروسكوپي Field ‌باشد (‌وقتيكه با بزرگنمايي 40 با روغن Immersion بررسي شود) .بوسيله پي پت 100μl آنتي ژنها را با مكش يكدفعه روي لام ريخته كه پس از توزيع محلول شيزنت يا پيروپلاسم يك لايه Monolayer در هر كدام باقي مي ماند. اينكار را براي هر حفره انجام داده تا مايع تمام شود. بااين روش تقريبا“‌مي توان 600لام با كيفيت خوب كه حاوي 6 هزار سلول در هر نقطه آنتي ژن باشد بدست آورد . گسترشها را درمعرض هوا خشك كرده ودراستن بمدت ده دقيقه ثابت كرده (‌Fixation)‌ وبطور جداگانه دردستمال كاغذي پيچيده و سپس در كاغذ آلومينيم (‌فويل آلومينيم ‌) ‌وبعد در محفظه ضد آب و هوا دردماي20- درجه سانتيگراديا 70 - درجه سانتيگراد نگه مي داريم . دردماي –20 درجه سانتيگراد بمدت يكسال قابل استفاده هستند ودردرماي –70 درجه سانتيگراد بمدت طولاني تر (‌دردماي يخچال 4 درجه سانتيگراد بمدت چهارماه قابل نگهداري هستند).



ب- محلول آنتي ژن شيزونت

ابتدا 500 ميلي ليتر از محلول T.annalataيا T. parva سلولهاي آلوده با غلظت 10 6cell/ml سلول سانترفيوژكرده (‌در 150 g دور دردقيقه براي ده دقيقه در دماي 4 درجه )‌ وسلولهاي ته نشين شده در100سي سيPBS سرد دوبار شستشو مي دهيم.

قابليت زنده بودن سلولها را بوسيله اوزين Eosin يا Trypan blue بررسي ميشود (‌كه بايد بيش از %90‌باشد )‌محلول سلولها بايد درمحلول سرم فيريولوژي سرد رقيق شود تا غلظت 7 10سلول (/ml Cell) بدست آيد دراين حجم ، ‌دوبرابرآن را محلول سرد شده حاوي 80%‌ استن و 0.1 % فرمالين در PBS قطره قطره اضافه كرده (‌در درماي –20 درجه )‌تا درمدت 24 ساعت به تثبيت رسد.

سلولهاي ثابت شده را سه بار شستشو داده (‌در سرم فيولوژي سرد شده دردماي 4 درجه ) و‌در 200 دور دردقيقه بمدت 20 دقيقه سانترفيوژ ميكنيم. بعد از آخرين شتشو سلولهاي ته نشين شده را در سرم فيولوژي رقيق كرده تا غلظت 107/ml بدست آيد . بميزان 5/0 سي سي سلولهاي ثابت شده را جدا جدا برداشت و تقسيم مي كنيم .



تهيه اسلايد حاوي آنتي ژن پيروپلاسم:

مرحله پيرپلاسمي گونه هاي تيلريا را نمي توان دركشت سلول نگهداري يا تهيه نمايند. زيرا آنتي ژن پيروپلاسمي بايد از حيوانات زنده آلوده تهيه شود و عفونتهاي تجربي بوسيله تزريق زير پوستي با اسپروزئيت يا كنه هاي آلوده باT.parva T.taurotragi ,T.annulata , صورت ميگيرد. آلودگي گروه انگلي T.sergenti/ T.buffeli/ T.orientalis ,T.mutans or T.velifera بوسيله تزريق داخل رگي خون حيوان ناقل به گاو يا گوساله طحال برداشته و يا تماس با كنه آلوده ايجاد مي شود. وقتيكه آلودگي پيروپلاسمي بيش از 5% ‌باشد، صد ميلي ليتر خون آلوده آغشته با مواد ضد انعقاد را بخوبي با PBS مخلوط مي كنيم . اين مخلوط را سانترفيوژ كرده (‌با500دور در دقيقه براي ده دقيقه)‌ و بعدپلاسما و Buffy Coat را جدا كرده و RBC هاي باقي مانده را بادوليتر PBS رقيق مي كنيم. سپس دوباره سانترفيوژ كرده وهمينطور Buffy coat را جدا ميكنيم . اين عمل رابراي چهار بار تكرار مي كنيم و بعد از پنجمين ششتشو، مقداري از RBC هاي جمع شده Packed RBC را با PBS مخلوط كرده واز آن 5μl روي هر اسلايد مي گذاريم. نقاط خشك شده را با متانول تثبيت كرده وبا رنگ آميزي گيمسا رنگ ميكنيم ونهايتا زيرميكروسكوپ نوري بررسي مي كنيم . تقريبا ده هزار اسلايد آنتي ژني (‌صد هزار نقاط آنتي ژن ) ا ز100سي سي خون آلوده‌ تهيه مي شود. اسميرهاي آنتي ژني را در دماي اتاق خشك كرده وبعد در دماي 4 سانتيگراد درجه در استن بمدت ده دقيقه فيكس ميكنيم. اسميرهاي فيكس شده شبيه اسلايدهاي آنتي ژني شيزونت نگهداري ميشوند.



محلول يا سوسپانسيون حاوي پيروپلاسم :‌

يك روش تهيه آنتي ژن براي T.parva قبلا“‌شرح داده شد دراين روش صد ميلي ليتر از خون حيوانيكه شديدا“‌ در مرحله آلودگي پيروپلاسمي باشد گرفته و مانند آنچه شرح داده شد،گلبولهاي قرمز تجمع كرده را به PBS اضافه كرده تا محلول 5%‌ بدست آيد.- در مراحل فوق بايد آنتي ژن را استانداردكرد-

تهيه lysate‌Bovine Lymphocyte : اين ماده طبق روش Godderis et al. براي بررسي محلول آنتي ژن T. parva بكار مي رود . ابتدا يك گوساله سه ماهه كه طحال آنرا برداشته اند را درنظر گرفته و واز طريق تماس با كنه و يا پشه تسه تسهtse Tse آلوده مي كنيم وروزانه بمدت چهارهفته با رنگ آميزي گيمسا بررسي ميكنيم . نهايتا بعد از مرگ يا كشتن حيوان از تيموس و غددلنفاوي نمونه برداري مي كنيم .

بافتها را به قطعات كوچكتر تقسيم كرده ودر PBS سرد ( در دماي 4 درجه) بهمراه %45 /.0 مواد ضد انعقاد نگهداري ميكنيم . سلولها را از بافت بوسيله پارچه MUSLIN جدا كرده و سه بارشتشو با مخلوط PBS-EDTA ميدهيم و در دور 200 بمدت 20 دقيقه در دماي 4 درجه سانتريفيوژ ميكنيم . لينفوسيتهاي شسته شده را با PBS كه عاري از EDTA باشد، مخلوط مي كنيم تا غلظت نهائي CELL/ML 107*5 بدست آيد .

روش كار براي تشخيص آنتي بادي فلورسانس :‌

اسلايد شيزونت يا پيروپلاسم را از دماي انجماد، 20- درجه سانتيگراد در آورده و بمدت 30 دقيقه در دماي يخچال، 4 درجه گذاشته و سپس 30 دقيقه ديگر در دماي اتاق ميگذاريم.

بوسيله پي پت پاستور 100/μl آنتي ژن را روي هر لام ريخته ودردماي اتاق 37 درجه خشك مي كنيم . ميتوان براي تلعلع بهتر وديد بهتر از Evansblue نيزبهمراه رنگ فلورسانس استفاده كرد و بعد در گلسيرول 50% در pH 8 ميگذاريم تا رنگ Fluorescein isothiocyanate بمدت طولاني تر و عميق تر اثر گذارد . اسلايدهاي تهيه شده تا 72 ساعت در دماي 4 درجه د رتاريكي قابل نگهداري و استفاده ميباشند. بدنبال عفونت با اسپروزئيت ها آنتي بادي هاي توليد شده بر عليه T.parva و T.annulate ابتدا" بين روزهاي دهم تا 14 برعليه شيزونت ودر بين روزهاي 15-21 بر عليه پيروپلاسم قابل تشخيص مي باشند. پادتنها بعد از بهبودي ناپديد مي شوند ووابسته به فاكتورهاي متفاوتي از جمله وضعيت ناقل، ‌فاصله مابين درمان، درمعرض قرار گرفتن و تماس دوباره با كنه آلوده تغيير مي كنند. معمولا“ ‌4 تا 6 ماه بعد از آلودگي آنتي بادي پائين مي آيد (‌در صورتيكه تماس دوباره پيش نيايد).

بدنبال آلودگي با T.mutans آنتي بادي در روزهاي دهم تا 15 قابل اندازه گيري بوده و بعد از 12-24 ماه پائين ميآيد.